【研究】活性炭-葡糖淀粉酶回收中的潜在物质

发布日期：2018-11-16 11:07 来源：活性炭网作者：活性炭网浏览数：

研究了活性炭在真菌葡糖淀粉酶纯化中的潜力。使用各种浓度的活性炭（1-4％w / v）在不同温度值（30-50℃）下浓缩来自 Rhizopus oligosporus的粗葡糖淀粉酶。还监测pH（3.0-6.0）和接触时

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1.简介

酶纯化是充分理解酶的性质和作用机制的必要先决条件[ 1 ]。这通常通过多步骤过程进行，包括生物质分离，浓缩，初级分离，纯化和抛光作为主要单元操作[ 2 ]。使用硫酸铵沉淀从发酵液中除去胶体颗粒和酶杂质的常规方法可能需要大约12-16小时的透析以进行产物回收，并且由于构象变化常常导致蛋白质变性[ 3 ]。使用聚乙二醇或聚乙烯醇来提高蛋白质和酶的浓度也受到吸水能力差的限制[ 4]。同样，使用羧甲基纤维素，鞣酸，和食用胶作为沉淀剂和以及有机溶剂的也带来的产物回收的问题[ 5，6 ]。凝胶过滤技术也被认为是费力且昂贵的发展中国家[ 6，7 ]。

活性炭是一种广泛用于处理废水和工业污染物的吸附剂，因为它具有高去除能力和对各种污染物的适应性[ 8 ]。它由任何基本上含碳的材料制成。树皮，煤炭，棉花废料，棕榈仁壳和许多农业副产品可用于生产活性炭，并且已经报道了它们去除颜色的能力[ 9 ]。

活性炭用于除去引起令人讨厌的味道，颜色和气味在水处理而其工业应用涉及除去有毒气体和农药的和以及有机化合物[纯化化合物10，11 ]。众所周知，世界上生产的活性炭的80％左右在有机和无机化合物[的水相吸附用12，13 ]。尽管已经报道了活性炭在酶转化的葡萄糖浆的脱色中的应用，但其在微生物酶的纯化中的用途很少。该研究报告了活性炭在真菌淀粉酶回收中的应用。

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2。材料和方法

2.1。微生物

从Rhizopus oligosporus的淀粉分解菌株获自尼日利亚阿贝奥库塔农业大学微生物学系的培养物收集中心。将其保持在4℃的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上并且每两个月进行传代培养。

2.2。化学制品

活性炭，3,5-二硝基水杨酸和聚丙烯酰胺来自Sigma。所有化学品均为试剂级。

2.3。淀粉酶生产

制备米糠固态培养基，并根据Akpan等人的方法用Rhizopus oligosporus的孢子接种。[ 14 ]。孵育在30℃下72小时。通过混合发霉的麸皮回收粗淀粉酶。将发霉的麸皮与乙酸盐缓冲液（0.2M）（pH 4.5）以1：4（w / v）的比例在锥形烧瓶中混合。将混合物在轨道振荡器上以150rpm在28℃下振荡1小时。然后用细棉布过滤提取物。将滤液用作粗淀粉酶并保持在4℃。

2.4。淀粉酶活性的测定

通过将粗淀粉酶与4％w / v糊化木薯淀粉（pH 4.5）混合并在60℃下孵育1小时来测定淀粉酶活性。使用Miller的二硝基水杨酸法测定还原糖[ 15 ]。如Koch和Putnam所述，使用缩二脲方法估计蛋白质浓度[ 16 ]。

2.5。用活性炭纯化粗淀粉酶

使用活性炭（0.8mm）对葡糖淀粉酶的纯化进行研究。将各种浓度的活性炭（1-4％w / v）加入到粗葡糖淀粉酶（pH4.5）中，并在30℃下孵育30分钟，偶尔搅拌。然后将混合物在台式离心机中以2500rpm离心10分钟。在不同温度值（30-60℃）下评价温度对活性炭酶净化能力的影响。还在不同的pH值（3.5-6.0）下测定pH对葡糖淀粉酶纯化的影响。

2.6。电泳

如Laemmli [ 17 ] 所述，使用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳估计纯化酶的分子量。用Coomassie Brilliant blue R-250（BioRad，USA）染色凝胶。估计蛋白质条带并与标准蛋白质标记物（BioRad，USA）比较。

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3。结果与讨论

3.1。木炭浓度的影响

图1中显示的结果显示了不同浓度的活性炭对真菌淀粉酶的纯化的影响。随着木炭浓度增加至3％w / v，最佳比活性为250U / mg，葡萄糖淀粉酶的比活性显着增加。进一步增加超过3％（w / v）导致其具体活动减少。在处理过的样品中观察到浊度降低约90％。观察到吸收速率随着所用木炭量的增加而变化。据报道，吸附程度受吸附质对吸附剂的可及性的影响[ 18 ]。

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图1

活性炭浓度对葡萄糖淀粉酶纯化的影响。

3.2。温度对淀粉酶纯化的影响

图2中显示的结果总结了时间和温度对使用活性炭纯化淀粉酶的影响。显然，在升高的温度下通过木炭纯化真菌淀粉酶使真菌淀粉酶的比活性显着增加。在50℃下，在20分钟的停留时间内达到520U / mg的最佳比活性。然而，在超过50℃的温度下和在超过30分钟的较长时间内用木炭进行酶处理导致淀粉酶活性降低。显然，升高的温度增强了活性炭的蛋白质吸收和脱色能力。率和吸收能力主要依赖于活性炭，接触时间和温度[的表面化学8，19]。

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图2

温度对使用活性炭（3％w / v）纯化葡糖淀粉酶的影响。

3.3。pH对葡糖淀粉酶纯化的影响

表1显示了pH对活性炭纯化真菌葡糖淀粉酶的影响。观察到pH值在4.5和5.5之间增强了真菌淀粉酶的比活性，在pH5.5下具有最佳纯化指数。然而，在pH≥5.5时，酶的比活性降低。本文符合淀粉酶的最佳pH范围[ 20 ]。能够在pH4.0-5.5下纯化淀粉酶，其落入淀粉酶的最佳pH值内，这也是一个额外的优点。

表格1

pH对活性炭净化葡萄糖淀粉酶的影响。

pH值	淀粉酶活性U / mL	蛋白浓缩毫克/毫升	比活度U / mg
3.0	1430	14.16	101
3.5	1478	9.60	154
4	1598	8.83	181
4.5	1675	3.57	469
5	1684	3.20	526
5.5	1686	3.38	496
6	1640	3.87	424

3.4。优化条件下葡糖淀粉酶的纯化

在优化的条件下用木炭纯化葡糖淀粉酶，在一步中纯化16倍（表2）。结果显着改进了酶纯化的常规方法，例如硫酸铵沉淀。有趣的是，葡萄糖淀粉酶留在上清液中，并且已经注意到低浓度的活性炭的有效性是pH4.5的附加优势。酶不会与活性炭一起沉淀的事实可能是由于蛋白质的选择性吸收，这归因于细孔网络，孔径分布，表面官能团类型，接触时间和温度[ 8，19 ]。

表2

葡糖淀粉酶的纯化概述。

脚步	淀粉酶活性U / mL	蛋白质mg / mL	比活度U / mg	净化折叠	产量％
粗淀粉酶	1702	50	33	-	100
活性炭	1684	3.2	526	16	81

在高纯度倍数下从复杂的发酵液混合物中快速纯化酶，使活性炭优于常规纯化技术。从工业的角度来看，常规的酶纯化方法包括盐析技术，溶剂沉淀和凝胶过滤并不总是经济的，因为它们与一些问题有关，特别是当处理经常含有的粗提物时难以放大和堵塞。粘性和颗粒材料[ 18，21 ]。此外，分离过程中使用的材料的回收或处理可能会增加分离步骤的成本，因此，发展经济是昂贵的[ 19]。因此，活性炭的使用被认为是酶纯化的替代方法。纯化的葡糖淀粉酶（平板1）的SDS-PAGE分析结果显示两个主要的蛋白质条带，相应的分子量为36kDa和50kDa，属于真菌葡糖淀粉酶的表观分子量（见图3）[ 18 ]。

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图3

在SDS-PAGE凝胶上纯化的葡糖淀粉酶的分子量。

除了活性炭的低成本高效的表面吸收特性可以被利用为发酵介质的去极化为有效回收和工业酶，它可以使下游加工在大规模工业生物过程的纯化更成本有效的[ 19，21 ]。结果证实活性炭是一种良好的澄清剂，并揭示其作为酶浓缩物质的潜力。

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4。结论

在该研究中，通过活性炭在50℃下从发酵液中回收葡糖淀粉酶20分钟。在洗脱过程之后，在不到30分钟内获得高度浓缩和纯化的葡糖淀粉酶。该技术在工业酶的下游加工中看起来很有前景，便宜且快速。

(责任编辑：活性炭网) 织梦二维码生成器

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