背景

药用植物是大自然保护人类免受各种疾病侵害的重要组成部分，引起了研究者对其生物活性分子合成，整个生物通路框架，转录组网络和其他分子和细胞机制的揭示的关注。Azadirachta indica（家族：楝科（Meliaceae））因其多样化的功效和无所不能的药用价值而被普遍认为是大自然的奇迹之树。Azadirachta indica的所有部分如水果，叶子，种子，花，树枝，根，树胶，茎和树皮已被用作各种人类疾病的家庭疗法[ 1]]。此外，它还被确定为天然杀虫剂，杀虫剂，抗疟剂和农用化学品的潜在来源[ 2 ]。在过去的几个世纪中，从Azadirachta组织的不同部分分离出约140种化合物，并在各种体内模型中测试其对多种疾病（如癌症，疟疾和各种真菌和细菌感染）的生物活性。印楝素是一种主要的柠檬苦素衍生物，以其抗饲料和抗疟疾活性而闻名，广泛存在于印楝中果实内果皮以及其他次生代谢产物如gedunin，nimbin，meldin，isomeldin，mahmoodin和nimocinol。其他药学上重要的化合物如沙兰素和槲皮素主要分别存在于果实中果皮和叶中[ 3 ]。现在正在利用生物技术工具来鉴定和表征代谢途径的酶和基因，所述代谢途径负责来自籼稻的这些药学上重要的次级化合物的生物合成，以造福人类。

在大多数生物技术和分子研究中，高质量的RNA是下游应用和工具的主要必需品，但是，由于富含多酚，多糖，黄酮类化合物，因此从许多药用植物中提取它是繁琐的。生物碱，萜类化合物，醌等多种化合物。自标准RNA提取方法如硫氰酸胍苯酚 - 氯仿法[ 4 ]，改性热硼酸盐法[ 5 ]和十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）[ 6]]无法从富含次级代谢产物和多糖的几种植物中提取适当质量和数量的RNA，因此，一些研究人员尝试对提取程序进行修改，以分离用于下游应用的优质RNA。其用于去除多酚，多糖和其他复杂的二级代谢物的反措施以稀释的多酚和在提取缓冲液中的乙烯基吡咯烷酮聚合物（PVP或PVPP）的增加在萃取缓冲液的体积[ 7，8 ]。还尝试了用于去除多酚化合物的高分子量聚乙二醇（PEG）[ 9]。除此之外，在萃取缓冲液中加入更高浓度的β-巯基乙醇（一种强还原剂）可防止酚类氧化成与核酸共价偶联的醌[ 10 ]。使用水饱和酚然后用乙酸沉淀的提取方法保持pH低（酸性），这增加了RNA稳定性[ 11 ]，并且使用具有高离子强度的提取缓冲液与氯化锂沉淀有效地防止多糖的共沉淀。与核酸一起[ 12]。在具有复杂二级化合物的多种植物系统的情况下，RNA提取程序中的这些修饰也失败。最近，报道了富含次级代谢产物[几个特定的和坚韧的药用植物系统修饰的RNA分离方法11，13 ]。甚至还尝试对商业试剂盒进行修饰以从富含次生代谢物的植物中获得高质量的RNA [ 14]。仍然需要开发和验证可用于属于不同家族的多种复杂植物的方法。从二次富代谢物的植物组织的几个DNA的提取和纯化方法，其中报告的活性炭有或没有PVP被用于有效地去除多酚和次级代谢物[的15，16 ]。活性炭是一种碳，已被广泛用于去除水，土壤和空气中的各种污染物，其吸附能力已被证明可用于制药，工业和微生物学。它还成功地用于植物组织培养，以防止由于释放到培养基中的过量多酚而导致的生长抑制[ 17]]以及去除PCR抑制剂和提高实时PCR反应的灵敏度[ 18 ]。

为了实施生物技术工具以在分子水平上研究富含次级代谢物的复杂植物，需要独特的RNA分离程序。我们利用活性炭的吸附性能以及PVPP和RNA提取缓冲液中不同浓度的其他成分，有效去除了从印楝（Azadirachta indica）分离的RNA制剂中的多酚和其他复杂的次级代谢产物，并进一步测试了多种其他复合药物。和芳香植物。最近，的转录A.籼稻进行分析并报道了用于总RNA分离物[市售的试剂盒19，20]。在本报告中，我们开发了一种简单，稳健且具有成本效益的RNA提取方法，可以在任何分子生物学实验室使用一般的RNA分离化学品和活性炭非常容易地进行。市售的试剂盒通常产生有限量的总RNA，有时可能需要多次提取。我们开发的方法优于商业试剂盒，因为它可以方便地按比例放大以产生大量的总RNA，并且可以避免多次提取。我们改进的RNA提取程序产生了大量的RNA，其质量极佳，不含各种污染物，包括多糖，多酚和有色的次生代谢化合物，并且适用于敏感的下游生物技术应用。

方法

结果和讨论

在印度楝（Azadirachta indica）的不同组织中产生的各种组织特异性药学上重要的二级化合物吸引了我们的注意力，以在分子水平上揭示它们的生物合成。为了制备cDNA文库，我们尝试使用标准的异硫氰酸胍（GITC）和盐酸胍（GH）方法从印度楝树的不同组织（幼叶，成熟叶，未成熟果实，成熟果实，内果皮和中果皮）中提取RNA。。基于GITC和GH的提取方法广泛用于模式植物，例如拟南芥和水稻，其提供非常好的RNA产量和质量。基于胍离子的标准方案不会从A. indica的组织中产生任何RNA。然后，我们尝试在基于胍离子的提取缓冲液中使用PVP或/和PVPP，其通过H-键与多酚形成复合物，但不能获得任何RNA产率。在连续多次失败后，我们转而采用基于CTAB的提取程序[ 6 ]和药用植物沙棘的改良版[ 11 ]。还按照制造商的说明尝试了来自QIAGEN的市售RNA提取试剂盒。即使使用基于CTAB的方法和试剂盒，也不能获得RNA。我们认为从A. indica中提取RNA的失败使用标准程序的组织是因为植物富含多酚和其他复杂的次级代谢物。我们将提取缓冲液的组成改为200 mM Tris-Cl和50 mM EDTA以及1.5％PVPP，其具有强H-受体，用于结合和去除多酚​​[ 8 ]和3-4％β-巯基乙醇（更高浓度）提供高度还原的环境来阻止多酚氧化成醌，这已知与核酸共价复合[ 10 ]。据报道，通过提高提取缓冲液的离子强度或改变最终的洗涤步骤，可以提高RNA的产量和质量[ 11]。通过使用高浓度的NaCl（2.5M），然后进行乙酸沉淀或LiCl选择性沉淀并用2M LiCl洗涤以在RNA提取的最后步骤中除去多糖，提高提取缓冲液的离子强度通常适用于许多坚韧的植物系统[ 8，11 ]，但它产生了非常低的量，并从总RNA的质量差印楝（图（图1，1，图A）。在所述的RNA提取从困难印楝 组织表明可能存在大量的多酚类物质以及更多其他复杂的次级代谢物，这些代谢物不能通过PVPP有效去除，并可能阻碍RNA的提取。

 

图1

使用改良的基于CTAB的方法，从A. indica和其他植物组织中分离的总RNA的变性琼脂糖凝胶电泳。（A）通过使用仅含PVPP的改良提取缓冲液和使用冰醋酸进行沉淀分离的总RNA的质量。（B）通过使用仅含活性炭的改良提取缓冲液分离的RNA和使用冰醋酸进行沉淀。（C）通过使用含有活性炭和PVPP的改良提取缓冲液提取的RNA，然后进行冰醋酸沉淀。（D.）使用含有活性炭和PVPP的改良提取缓冲液提取RNA，然后进行2.5M氯化锂沉淀。（E，F）通过使用我们修改和优化的方案从印度楝（Azadirachta indica）和其他药用植物和芳香植物的不同组织中提取的RNA 。

活性炭的使用被报道在几个的DNA提取程序[ 15，16 ]。碳基杂质如含有生色基团和大有机分子的化合物被活性炭可逆地捕获和吸附。为了实现RNA产量，我们利用活性炭（AC）的吸附潜力在初始步骤本身的RNA分离过程中有效去除阻碍的次级代谢物，因为包含多酚的胞质溶胶二级化合物与AC和所有AC-相关。通过初始离心步骤可以完全除去包括颗粒AC的捕获污染物。在提取缓冲液中包含0.03-0.1％AC可以产生显着量的来自A. indica的总RNA组织和O.罗勒叶（图（图1，1，小图B），将其进一步通过添加PVPP的用活性炭（图沿改善（图1，1，图C和d），该细胞溶胶源性次生代谢化合物比核酸更有效地与活性炭（AC）结合，并且由于碳环的sp2-电子构型，PVPP在AC上结合多酚也具有协同效应[ 15 ]。上述提取缓冲液的改进和使用冰醋酸进行差异沉淀可以从A. indica和O. basilicum中提取质量和数量的RNA叶（图（图1，1，C组），因此，开发一种溢价和修饰的RNA提取方法，我们还通过使用氯化锂（LiCl），而不是乙酸在我们的经修改协议测试的选择性沉淀，这种变化得到非常良好的质量和总RNA的量从O.罗勒叶和不同组织印楝（图（图1，1，D，E）。最后，开发并标准化了一种优良且适用的已知具有大量多酚和复杂次级代谢产物的植物RNA提取方法，并进一步应用于各种其他13种复杂药用植物和芳香植物的测试。家庭和具有药物和工业重要性，如R.大马士革，穿心莲，P.天竺葵，T.菊，M.河豚，W.羊草，C.苜蓿，S.椇，B.蛇床子等（表  1和图如图一，1，小组F）。从 A. indica和其他植物系统的组织获得的总RNA通过分光光度法定量，并分别通过采用A260 / 280和A260 / 230比率分析蛋白质和多糖的可能污染。在不同的测试植物中，从相同量的植物组织产生的总RNA量从10±01μg/ g到354±36μg/ g不等，但总RNA量良好，具有适当的A260 / 280和A260 / 230比率（表 1），而且，总RNA的质量也高由不同的28S和18S rRNA基因的存在明显没有任何降解（图（图1，1，E组，F）。该方案从不同的组织组中重复至少三次，并且发现其是可重复的和准确的。该方案可以成功地分离来自A. indica mesocarp和A. vera组织的总RNA，其本质上是高度多汁的，尽管与其他植物组织相比获得的量非常低。

对于几种敏感的下游应用，RNA的完整性至关重要。通过在变性的1.2％琼脂糖凝胶（含有3％甲醛）以及Agilent 2100生物分析仪中可视化的rRNA条带的强度和清晰度来检查总RNA的完整性。用于加载在变性琼脂糖凝胶中的RNA样品在预混物[20×MOPS /甲醛/甲酰胺中以1：3.5：10的比例]制备。在65℃下对所有样品混合物进行热冲击5分钟，并在冰上快速冷却5分钟以熔化任何二级结构。将这些样品与上样染料混合，并在1×MOPS电泳缓冲液中以5V / cm运行。将凝胶用EtBr染色并在UV透射仪下显现，其显示出清晰且明显的条带，并且28S和18S rRNA之间的亮度比率接近2：（图1，1，面板DF）。接下来，还使用Agilent 2100生物分析仪中的Agilent RNA 6000 Nano Kit分析了我们的方法制备的总RNA的完整性和质量。的RNA完整性数（RIN值），由Agilent 2100产生的电泳和凝胶类图像生物分析仪显示，从分离的总RNA印楝组织是可接受的质量（图（图2）。2）。我们采用分光光度法分析了 A. indica组织RNA制剂的纯度，采用A260 / 280和A260 / 230比值，分别为1.87±0.02至2.04±0.07和1.77±0.07至2.32±0.15（表 1））。此外，安捷伦2100生物分析仪产生的RIN值也介于6.6至8.0（图（图2）2），其进一步表明总RNA为敏感的下游应用的可接受的质量。

 

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图2

使用Agilent 2100生物分析仪，通过我们的改良方法从各种A. indica组织中制备的总RNA的电泳。（A）小RNA梯和A. indica组织的生物分析仪凝胶图像。（B - E）生物分析仪产生了A. indica未成熟果实，成熟果实，中果皮和内果皮的电泳图。还显示了相应的RNA完整性编号（RIN）和核糖体比率。

涉及逆转录和构建消减cDNA文库的步骤对起始材料（RNA）中的杂质非常敏感，因此必须分离高质量的RNA以成功构建文库。为了破译参与组织特异性次级代谢的基因，使用通过我们标准化的修改方法提取的RNA制备使用籼稻的幼叶和未成熟果实组织的消减cDNA文库。所述的mRNA从总RNA中由此分离并用于构建在其中的mRNA从未成熟果实取作测试仪和幼叶mRNA作为驱动器和两个独立的消减cDNA文库纯化反之亦然（图（Figure3，3，小组A）。减后的cDNA随后通过初级和次级PCR（图扩增（Figure3，3，小图B，C），在TA克隆载体连接，并在转化的大肠杆菌中通过电穿孔（DH10B）细胞。文库的质量通过随机挑选的克隆和分析插入物通过限制性消化的存在（图检查（Figure3，3，面板d）。质粒的95％以上已经插入成功克隆。我们随机测序几个EST和序列读数是发现具有良好的质量。代表性EST的电泳图的快照显示在附加文件1中与附加代谢途径相关的推定基因很少见附加文件2。

 

图3

消减cDNA文库的构建和RT-PCR。（A）从A. indica组织中纯化mRNA 。（B，C）未成熟果实富集（B）和富含叶片（C）消减cDNA文库的一级和二级PCR 。（D）从未成熟的富含水果的消减cDNA文库中随机分离的质粒的限制性消化。（E）通过使用由我们的改良方法从A. indica的不同组织分离的总RNA制备的cDNA ，对细胞色素P450样基因（我们文库中的候选物）进行RT-PCR 。（F）限制性消化释放来自TA克隆载体（pGEMT-Easy）的细胞色素P450样基因片段证实其成功克隆。

逆转录PCR也是主要用于扩增目标基因以进一步下游使用的工具之一。我们使用我们建立的方案逆转录，使用从不同的A. indica组织（幼叶，未成熟和成熟果实）分离的总RNA 。为了验证所制备的cDNA的质量，我们使用cDNA作为模板PCR扩增了代表性的部分细胞色素P450样基因（GenBank - JK126235），它是我们EST池中的候选物。具体的和尖锐的PCR扩增表明，制备cDNA是一个很好的质量（图的（Figure3，3，小组E）。将如此扩增的部分片段（874bp）成功克隆到TA克隆载体中，通过限制性消化和测序进一步证实。

为了检查在我们的总RNA制备的DNA污染，我们PCR扩增的部分片段的肌动蛋白样基因（GenBank- JK624074）和延伸因子样基因（GenBank- JK624104），使用有代表性的候选EST在我们的消减文库池，总RNA（无RT）和cDNA（阳性对照）作为模板。一种特异性和尖锐的PCR产物，用于肌动蛋白样基因的部分片段和延伸因子样当cDNA用作模板时注意到基因，而在总RNA的情况下没有观察到扩增（没有RT）。这表明使用我们改进的方法制备的总RNA不含任何种类的DNA污染，并且可用于敏感的下游应用（附加文件3）。

结论

我们提出了一种改进的方案，用于从印度楝（Azadirachta indica）中分离出优质的总RNA这是一种药用植物，含有大量的单宁，多糖，多酚和其他次生代谢化合物。这种开发的协议也适用于属于不同家庭的其他复杂植物系统，其中其他常见和修改的方法通常都会失败。我们首次使用活性炭进行RNA分离，并在基于CTAB的修饰缓冲液中使用PVPP证明是成功的。提取缓冲液的高离子强度，选择性沉淀和改进的洗涤步骤避免了多糖与RNA共沉淀。通过该修改方案获得的RNA具有高质量并且适用于对污染物敏感的下游分子和酶应用。