微生物群落组成

运行51天后，通过宏基因组鸟枪测序分析了种子污泥污泥样品，无AC（A1）的对照反应器和添加12g AC（A2）的AD反应器中的整个微生物群落。多物种分类学分析表明，细菌和古菌种群是主要的微生物群落，占总微生物种群的97％以上（图  2A，B）。剩下的种群是Metazoa，Unclassified Viruses，Fungi，Viridiplantae和Plasmodium_chabaudi，只显示了整个微生物群落的一小部分。分层聚类分析（图  S2）表明种子污泥和A2中的微生物群落被分类为一个群集。该簇与A1分离，表明A1中的微生物群落结构在没有添加AC的情况下显着改变。

 

图2

A1（A）和A2（B）污泥样品运行51天后，整个AD微生物群落的多级物种分类示意图。通过分析合并的基于配对末端的16s rRNA基因，在结构域和门水平上鉴定了从内部到外部环的微生物群落组成。根据GraPhlAn分析，反应器A1（C）和A2（D）中显性AD微生物群落的系统发育和分类树。选择前100个属来构建系统发育树，并将前20个属的相应门（标有星号）标记为不同颜色。圆圈和星号的大小代表微生物种群的不同相对丰度。

图S3中差异比较的误差条形图  进一步表明A2和A1与种子污泥之间微生物群落的差异主要归因于变形菌，拟杆菌和Euryarchaeota的比例（p <0.05）之间的差异。Proteobacteria和Bacteroidetes包括发酵，产乙酸和同种异体细菌，可以发酵有机化合物和降解VFA 17。如图2C中的循环系统发育树的外环  所示，D，Proteobacteria下的两个显性属（Smithella，Desulfobulbus）由于添加了AC，在细菌群落中的拟杆菌下的两个显性属（黄杆菌和Lentimicrobium）在A2中被选择性富集。A2中Proteobacteria的相对丰度为总微生物群落的16％，而A1中仅为5％。发现具有将硫酸盐还原为硫化氢的能力的Desulfobulbus也通过发酵复合有机化合物18参与丙酸盐和乙酸盐的生产。Smithella是典型的互补性VFA氧化细菌，已知会将丁酸盐和/或丙酸盐降解为乙酸盐并产生H 2。该属通常通过IHT 与H 2 -利用产甲烷菌具有亲缘关系。拟杆菌属中的大多数属于水解和发酵细菌19，例如黄杆菌属和Lentimicrobiu属，以及其他属，例如拟杆菌属和Alistipes。这些属参与VFA，CO 2和H 2的产生，通过碳水化合物，脂质和蛋白质发酵多糖和蛋白聚糖切割产生的酶19，20。

Euryarchaeota包含AD反应器中的大多数产甲烷菌。从图  2A，B中，除了Thermoplasmata，Thermococcales和Halobacteria之外，Euryarchaeota门中超过93％的厌氧菌属于产甲烷菌。Euryarchaeota的相对丰富在A2中，微生物群落占总微生物群落的15％，显着高于种子污泥中的4％和A1中的3％。这些结果表明，在A2中添加AC有助于富集产甲烷菌，在AD过程中提高甲烷产率起着至关重要的作用。在代谢途径的基础上，产甲烷菌可分为乙酸产甲烷菌和利用氢的产甲烷菌。如图2C中的循环系统发育树的外环  所示，D，四种显性产甲烷古菌（A，B，C，D），三种氢营养型产甲烷菌（Methanoregula，Methanolinea，Methanoculleus）和一种乙酸产甲烷菌（Methanosaeta）。仅富含A2。即使通过A1也有3％的Euryarchaeota，每个属的相对丰度低于总微生物群落的1％。在A2的污泥样品中，Methanosaeta占总微生物群落的5％。众所周知，Methanosaeta能够通过参与DIET 10直接接受来自CO 2还原的电子以产生CH 4。然而，DIET仅被报道的定义共培养物发生Geobacter metallireducens则和地杆菌硫还原或地杆菌物种和乙酸分解甲烷10，21。Geobacter包括在内变形菌。如图S4所示，  A2 中Geobacter属的相对丰度为细菌群落的0.8％，远高于A1中的0.08％和种子污泥中的0.3％。Geobacter metallireducens则和地杆菌硫还原是两个主要的地杆菌在A2种占总数的25％，地杆菌的物种。随着Methanosaeta属和Geobacter属的增加，Geobacter和Methanosaeta之间的潜在饮食可以建立以改善AD中间产物（例如丙酸盐，丁酸盐和乙醇）的同种异体代谢。因此，通过添加AC，可以增强DIET对A2中FW的AD的贡献。此外，占优势的氢营养型产甲烷菌，Methanoregula，Methanolinea和Methanoculleus，占古菌群落的41％。氢营养型产甲烷菌的富集在通过将CO 2 / H 2还原为CH 4来保持低H 2压力中起主要作用，并且已经发现通过营养不良的氧化细菌22对VFA向乙酸盐的共同代谢具有重要作用。

微生物网络和共同网络

AD过程通常需要多组微生物共同作用以将有机底物转化为甲烷。因此，为了研究与整个微生物群落变化相关的彻底的微生物网络，了解不同微生物之间的关系是非常重要的。特别是，分析AC对微生物群落的影响至关重要。如图3A所示 ，构建了微生物共生网络，以显示A1，A2和种子污泥中所有微生物之间的相关性。所有饼图的面积相似，只是“其他”的馅饼由几种非显性微生物组成，这表明每个微生物属的相对丰度的差异几乎不显着。该结果可能部分归因于底物和降解过程的复杂性，其通常需要多个属的联合作用，与可能仅需要有限量的属的简单底物如乙酸盐相比。馅饼“其他”的较大区域表明，即使优势微生物通常在AD过程中起主要作用，一些非优势微生物的功能也是必不可少的。红线和绿线分别尊重不同属之间的正负相关。正相关通常包含交叉进食，共聚集，共定殖和生态位重叠23，有利于各种属中AD中间体的间充质代谢。在AD条件下，负相关通常源于对底物的竞争和差异生态位适应。大多数属的分布是密集的，除了位于外部边界的属，表明某些属与AD过程几乎没有关系，如病毒分类，Azospira和Mesotoga等，而一些属与AD过程不可分离，如拟杆菌和甲烷菌。

 

图3

（A）微生物共同网络揭示了反应器A1，A2和种子污泥的所有污泥样品中不同属之间的强烈相互作用。饼图表示每个属的相对丰度。红线表示正关联，而绿线表示负关联。（B）微生物网络，表明种子污泥，反应器A1和A2中共有的和独特的优势属。

为了进一步研究AC对不同属间相互作用的影响，构建了A1，A2和种子污泥中的一个完整的微生物网络，其中优势微生物种群在每个属间具有显着差异（P <0.05）（图  3B）。该微生物网络揭示了在复杂系统中观察到的拓扑特征，形成了共享的相关性和特定的相关性。主要的共同相关性归因于A1和A2反应器中存在的相同微生物，以及种子污泥中的细菌，例如拟杆菌，密螺旋体，厌氧菌和其他。这些属涉及将复杂的有机化合物发酵成简单的底物，例如VFA，CO 2和H 2。共有领域中这些属的聚集的一种可能的解释是水解和发酵是AD过程中的第一步，其通过水解和发酵细菌的作用可以在可变环境中存活。然而，在A2中添加AC改变了AD环境并通过形成一些特定的相关性来重塑微生物网络，这些相关性归因于仅在A2中存活的特定属，例如Lentimicrobium，Streptococcus，Sphaerochaeta，Methanoculleus和methanosaeta。Methanoculleus和Methanosaeta分别归类为氢营养型产甲烷菌和乙酸产甲烷菌。Lentimicrobium，Streptococcus和Sphaerochaeta是严格发酵的细菌，通过发酵复杂的有机物产生VFA，乙醇，H 2 / CO 2。

微生物群落的代谢途径

为了理解和利用AC对微生物代谢的影响，进行了微生物群落代谢途径的分析。A1和A2中微生物群落的预测功能分析如图S5所示 。所有代谢功能分为代谢，环境信息处理，遗传信息处理，细胞处理，人类疾病和有机体系统，其中代谢是最主要的类别，包括几种代谢途径，例如碳水化合物代谢，氨基酸_代谢，脂质代谢，能量代谢和其他。代谢中的这些代谢途径表示在FW和生物能量产生中负责碳水化合物，蛋白质和脂质的分解和矿化的各种生物化学过程。然而，A1和A2之间代谢途径的差异除了能量代谢和脂质代谢之外几乎没有显着差异。由于在A2中添加AC，它们在全基因组的相对丰度中分别提高了2％和1％。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）。如图S11所示，  A2中能量产生和转化以及脂质转运和代谢的基因数分别为15030和5395，而A1中仅为13863和4825。能量代谢的增强主要归因于甲烷代谢途径（Ko00680）（图  4），其中产甲烷菌通过在AD过程中将简单底物转化为甲烷而获得生长能量（图  S6A）。这可能是A2中甲烷产率较高的可能生物学原因。

 

图4

根据基因KEGG途径分析，微生物群落的代谢途径。（A，B）分别在A1和A2中的“代谢”类别中的整个微生物群落的功能概况分析。白色饼图表示基因ko00680在“代谢”类别中的相对丰度。

脂质代谢是指脂质的降解。脂质代谢的改善归因于脂肪酸降解途径，其中水解和发酵细菌通过几种功能酶的作用将长链脂肪酸和甘油脂转化为小分子脂肪酸（图  S6B）。脂质的降解仍然被认为是，因为包含在脂质生物难熔化合物的是主要包括脂肪和食用油的FW的AD的限制步骤14。此外，脂质的疏水特征易于影响脂质和微生物的混合，影响AD过程中脂质的降解。考虑到吸收能力，AC可以潜在地用作增强脂质代谢的有效添加剂，同时吸收脂质或油组分并促进微生物定殖，并随后通过微生物加速脂质的降解。为了证实这一点，使用食用油作为单一底物进行实验室规模实验以研究AC对脂质AD的影响。图  S7图中显示了在没有添加AC（CR）的情况下添加AC（ACR）和对照反应器的AD反应器中甲烷产率的变化。这两个AD反应器并联运行，增加OLR为1至6 g oil·d -1。在1g油·d -1的OLR下，两个反应器的平均甲烷产率在58和62ml·d -1之间变化，pH范围为7.0-7.2。这些差异并不重要。随着OLR的进一步增加，ACR的平均甲烷产量在OLR为6 g oil·d -1时单调增加至325 ml·d -1，平均pH值为7.3。CR的甲烷产率仅为175 ml·d -1并且平均pH保持在7.0。这些结果表明，在AD过程中添加AC可以增强脂质代谢，因此在改善FW处理和甲烷产生的AD性能中起主要作用。

A2中微生物代谢和特定代谢途径的共同网络

图  S8显示了A1，A2和种子污泥中微生物群落的代谢途径的共同网络。根据馅饼的面积，具有Ko01200和Ko01230数量的代谢途径是所有反应器中最主要的代谢途径。Ko01200是碳代谢，包含糖酵解的碳利用途径，甲烷代谢的一些途径，以及其他碳固定途径。Ko1230是氨基酸的生物合成途径，用于将碳基化合物转化为氨基酸。这两种代谢途径是AD过程中用于降解有机化合物和甲烷产生的最基本方面。第二个主要的微生物代谢与Ko00230，Ko02024，Ko02010，Ko00720和Ko00620的代谢途径相关，对应于嘌呤代谢，群体感应，ABC转运蛋白，碳固定途径和丙酮酸代谢分别。这些结果表明，即使操作条件变化很大，大多数功能性代谢也发生在A1，A2和种子污泥的污泥样品中。然而，Ko00640的特定代谢途径仅存在于A2中（图2）。 5）。这种代谢途径是丙酸代谢，其中丙酸盐可以被增生细菌降解产生乙酸盐和甲醇作为终产物（图  S9）。该结果与A2中丙酸盐百分比（32％）较低的结果一致，与A1中的43％相比（图  S10）。由于高的吉布斯自由能为+ 76.1kJ /反应，丙酸盐与乙酸盐的互收性产乙酸反应在热力学上是不利的，因此丙酸盐在AD系统中易于积累，导致AD操作的不稳定性。这可能解释了A1的糟糕表现。与富含 Geobacter物种和Methanosaeta的潜在DIET结果一起（图 2和S4）和A2（图丙酸酯低  S10），在AD过程中加入AC的可能有助于加速丙酸的互养代谢和进一步提高广告效果。

 

图5

KEGG途径树代表反应器A1和A2中AD过程中的主要代谢途径。外环中的星号表示反应器A1，A2的主要代谢途径。（A）反应堆A1; （B）反应器A2。

反应堆规格和操作

进行了两次实验室规模的实验。首先，操作四个玻璃实验厌氧消化器用于FW处理，添加不同含量的粉末AC（200目）：4g，12g，20g和28g。每个蒸煮器的工作体积为0.8L。对照蒸煮器与实验蒸煮器相同，但不添加粉末AC。粉末AC的孔体积和表面积分别为0.30cc / g和385m 2 / g。在播种种子污泥后，这五个厌氧消化器以半连续模式（每天喂养）操作FW的AD，随着有机负荷率（OLR）的逐渐增加。所有反应器在35℃下平行操作。污泥停留时间为30天。所有实验一式三份进行。

在获得FW AD的最佳AC剂量后，加入12g AC（以下称为ACR），操作两个玻璃实验厌氧消化器处理食物垃圾的食用油。对照消化器与实验消化器相同，但没有添加粉末AC（以下称为CR）。食用油用作唯一的底物。每个蒸煮器的工作体积为0.8L。所有反应器在35℃下平行操作。污泥停留时间为30天。所有实验一式三份进行。

分析方法

根据制造商的说明使用HACH色度计（DR900，USA）测定COD。使用pH分析仪（Agilent 3200M，USA）记录pH。在103-105℃下干燥并在550℃下燃烧成灰分后，基于称重法测定TS和VS. CH 4使用配备有热导检测器的气相色谱仪（Clarus 580 Arnel，PerkinElmer，USA）测定产量。使用vario MICRO cube（Elementar，HANAU，Germany）测定FW中的C，N，S和H元素分析。使用电感耦合等离子体（ICP） - 光学发射光谱仪（Perkin Elmer Optima 5300V，USA）进行金属元素分析。使用Quantachrome Autosorb-6B通过N 2吸附测量来测量活性炭的BET表面积和孔体积。根据Zhang 等人描述的方法，使用实时PCR来定量总古细菌。24。