介绍

野火形成独特的产品，与我们星球的碳和营养平衡相互作用。这些产品中的一些（例如字符，烟灰和化学特征）可在土壤，沉积物和古老岩石中追踪，并为我们提供地球过去火灾历史的记录。在这些产品中，沉积物和岩石中的化石炭提供了过去野火事件的最明确证据[1]，[2]。木炭可以洗涤，从沉积物中筛出，或通过酸消解从岩石样品中释放出来（例如[2]，[3]）。在两种情况下，将样品筛分（在125μm，150μm或180μm处）以将残余物分成微化石和中化石组分。通常，将微化石部分安装到孢粉学载玻片中并使用透射光显微镜研究，并使用低功率立体显微镜研究中间化合物部分[2]，[3]。然后由在显微镜下工作的研究人员和/或从数字上捕获的二维图像计数木炭颗粒的数量。

当使用数字图像时，可以使用图像分析系统来量化木炭颗粒的数量和表面积。这种系统依赖于黑色，不透明，基本上黑色的木炭颗粒之间的对比，以将它们与样品中的其他有机材料区分开。这允许使用简单的像素强度阈值来筛选出较亮的粒子。通常用于此目的的流行图像分析程序是Image J（http://rsbweb.nih.gov/ij/）。这种技术最适用于从第四纪前中弹药组分中采集的木炭或使用没有煤化颗粒的季铵老化样品，因为煤在数字图像中也显示为黑色，并且不能通过图像分析软件与木炭区分。这些方法允许在整个历史和地质时间内在不同样品中估计每体积沉积物或每克岩石的大量木炭颗粒和/或木炭面积。木炭丰度的这些变化被用来代表火灾活动的变化，通常是响应环境或生态变化（例如[4]，[5]）。通常用于量化泥炭，沉积物和岩石中木炭丰度的方法的良好评论可以在[2]中找到，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]。

众所周知，中化石炭丰度的峰值能够反映近期沉积物中流域内野火的发生率（例如[8]））。然而，进一步的研究可以追溯到时间，评估个别火灾事件与化石木炭记录之间的关系变得越困难。解释这些记录的部分问题是由于在运输和沉积过程中木炭颗粒的不同碎裂。例如，考虑两种具有完全相同属性，相同植被，相同燃烧条件（例如气候，天气，火灾温度，蔓延速率等）的野火，并产生相同数量的木炭颗粒。在火灾事件之后，木炭颗粒通过不同的方式从现场运输，但沉积在相同的沉积环境中。在第一个例子中，通过陆地流动将木炭轻轻地洗入湖中，而在第二个例子中，木炭被洗涤成河流，作为床载运输并随后沉积在湖中。第一个例子可能会导致原始木炭颗粒碎片相对较少，而第二个选项最有可能导致严重碎裂。因此，这显然会增加沉积的木炭颗粒的数量。虽然木炭被认为是在同位素沉积单元（即湖泊沉积物）中发生的，但是它们沉积到湖中的方式将强烈地影响沉积前木炭的碎裂。

测量这些样品中木炭颗粒的总表面积可以解决碎裂问题，正如通常尝试使用季铵炭材料[10]。然而，总面积的使用仍然可能错过颗粒的三维方面，使得碎裂成薄的与厚的颗粒可能完全错过总木炭体积的真实变化。

在这里，我们使用共聚焦激光扫描显微镜和图像处理的新颖应用来重建单个木炭颗粒的体积，使得它们可以表示为给定体积的沉积物或每克岩石中的木炭总体积。我们的方法使用反射激光在微化石和介子化石载玻片上烧焦颗粒，并捕获载玻片内单个颗粒的三维图像。使用图像处理技术，我们能够重建幻灯片中每个粒子的体积。我们还量化颗粒面积，将其与颗粒体积进行比较，并考虑给定样品中颗粒的形态变化的多样性，以便使用标准的，容易获得的光学显微镜技术突出体积重建的可能性。

材料和方法

共焦激光扫描显微镜和木炭的3D体积渲染

所有载玻片使用Zeiss LSM710倒置共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss，Obercohen，Germany）在伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校基因组生物学研究所的核心设施中成像。使用Zeiss Zen 2010软件收集三维堆叠图像。因为木炭颗粒不是荧光的，所以使用T33 / 20二向色镜从633nm HeNe激光器使用反射光模式对它们成像，其中80％的入射激光被透射并且20％被反射。使用冷凝器上方的透射光检测器同时捕获透射光图像。使用Plan Apochromat 10×（0.3NA）或20×（0.8NA）物镜获得图像。表1中提供了图像采集细节。从光路移除反射抑制镜（在正常荧光模式中使用），这使得能够进行反射成像。因为使用给定物镜的反射平面或焦深受到波长和数值孔径的限制，所以使用该模式可以进行光学切片。使用连接到显微镜的精确（20 nm分辨率）自动z驱动器，我们通过样品的z轴（轴向深度）拍摄了多个2D图像。对于分析的两种木炭尺寸部分，使用的显微镜​​设置如表1所示。该显微技术允许通过捕获每个Z-堆叠焦平面穿过粒子的一组单独图像，从载玻片三维测量粒子的尺寸和形状。一个例子如图所示图1，从粒子的顶部到底部可以看到多个焦平面。载玻片的厚度变化很大，范围从40μm厚（Miombo微化石载玻片）到篝火炭的颗粒C中的215μm。在反射光（3维，xyz）和明场照明（2维，x-y）中同时捕获图像。我们以无偏见的方式在每张幻灯片中成像了100个粒子。木炭颗粒的成像始于每个载玻片的左上方，并且在从载玻片的边缘到边缘的直线横切之后研究每个视野的木炭。在样线上遇到的每个木炭颗粒都被成像，直到达到100的计数。（这需要多个横断面）。http://www.bitplane.com/go/products/imaris），它能够将堆叠的反射光图像组合在一起，例如图1，以创建木炭颗粒的三维重建（例如图2） - 4）。IMARIS能够显示多通道显微镜图像，以便从2D或3D图像中提供最佳信息。我们使用IMARIS中的Surpass View使用Surfaces可视化生成3D渲染。用户通过对图像进行阈值处理来处理每个图像以拾取所有相关体素（图像体积数据集内的最小单位）。阈值处理允许图像中的所有灰度值被分配特定功能（即，定义感兴趣的粒子）。可以在阈值处理中应用尺寸限制，以便例如移除小物体以清除噪声（平滑）。也可以通过这种方式筛选同样大的颗粒（尽管在该数据集中不排除大颗粒）。可以删除保留在阈值图像中的任何不相关的粒子或工件，使用适当的过滤器（基于面积）和重新处理的图像，以便只保留木炭颗粒。一旦定义了粒子，Surfaces可视化模块就会在图像数据集中生成计算机生成的特定灰度值范围的表示。它创建人造立体对象以可视化真实体积对象的感兴趣范围。表面由一系列连接的三角形定义，其中表面统计描述表面网格（三角形的数量，表面积，封闭的体积）。然后，MeasurementPro模块使用此信息计算每个粒子的形状统计数据。这使我们能够估计样品中烧焦颗粒的面积，体积，形状和分类。一旦定义了粒子，Surfaces可视化模块就会在图像数据集中生成计算机生成的特定灰度值范围的表示。它创建人造立体对象以可视化真实体积对象的感兴趣范围。表面由一系列连接的三角形定义，其中表面统计描述表面网格（三角形的数量，表面积，封闭的体积）。然后，MeasurementPro模块使用此信息计算每个粒子的形状统计数据。这使我们能够估计样品中烧焦颗粒的面积，体积，形状和分类。一旦定义了粒子，Surfaces可视化模块就会在图像数据集中生成计算机生成的特定灰度值范围的表示。它创建人造立体对象以可视化真实体积对象的感兴趣范围。表面由一系列连接的三角形定义，其中表面统计描述表面网格（三角形的数量，表面积，封闭的体积）。然后，MeasurementPro模块使用此信息计算每个粒子的形状统计数据。这使我们能够估计样品中烧焦颗粒的面积，体积，形状和分类。它创建人造立体对象以可视化真实体积对象的感兴趣范围。表面由一系列连接的三角形定义，其中表面统计描述表面网格（三角形的数量，表面积，封闭的体积）。然后，MeasurementPro模块使用此信息计算每个粒子的形状统计数据。这使我们能够估计样品中烧焦颗粒的面积，体积，形状和分类。它创建人造立体对象以可视化真实体积对象的感兴趣范围。表面由一系列连接的三角形定义，其中表面统计描述表面网格（三角形的数量，表面积，封闭的体积）。然后，MeasurementPro模块使用此信息计算每个粒子的形状统计数据。这使我们能够估计样品中烧焦颗粒的面积，体积，形状和分类。

 

在另一个窗口打开

图1

通过反射光中2个粒子的不同焦平面拍摄的一系列图像。

 

在另一个窗口打开

图2

大型“篝火”木炭颗粒的三维重建。

（A）原始反射光图像（B-D）图像处理的三维重建顶视图（X-Y）和侧视图（Z）（E-H）的所有颗粒视图。比例尺均为200μm。在图像H中，颗粒看起来具有扁平的基部，这种非常大尺度的篝火炭的扁平化通常不会在载玻片中成像，这是由于反射光从盖玻片的滑动件反弹回来。因此，在3D图像中删除了该图像的最后一层，使得粒子从背景中突出。这在通常安装在载玻片（例如内消旋和微量化石部分）中的颗粒的尺寸范围内不是问题。

 

图4

重建化石炭颗粒（A-D）古白垩纪中化石颗粒（A）反射光图像（B-D）图像处理三维重建显示颗粒的所有侧面。

（E-F）还显示了根据木炭体积对图像进行编码的能力，对于一系列粒子黄色=最大体积红色=最小。

表格1

蔡司LSM710激光扫描显微镜图像采集设置。

设置	大型“篝火”木炭和古代和现代的“mesofossil”部分	现代“微化石”部分
图像缩放X.	2.768μm	0.526μm
图像缩放Y.	2.768μm	0.526μm
图像缩放Z.	5.00μm	1.060μm
扫描模式	堆	堆
放大	0.6	1.6
目的	EC Plan-Neofluor 10X / 0.30 M27	Plan-Apochromat 20X / 0.82 M27
像素停留	1.58毫秒	1.58毫秒
平均	1	1
Photomultipleor Tube Master增益	反思：551 TRansmission：359	反思：551传输：359
数字增益	1	1
抵消	0	0
针孔	38微米	36微米
过滤器	415-735	415-735
分束器	主光束分离器：T80 / R20	主光束分离器：T80 / R20
激光	633 nm：7.5％	633 nm：7.5％

结果

作为这种新方法的第一次测试，我们在现代篝火中成像了大量的被子植物木炭颗粒，并重建了它们的体积。图2显示了所检查的三个大颗粒之一。包括xy平面中捕获的原始未处理反射光图像，其显示了粒子的一般xy形状特征及其表面纹理（图2A）; 处理后的图像，区域和体积估计的区域为红色（图2B），Z平面中粒子的厚度和轴向深度变化（图2C-D）; 和突出显示的三维特性（图2E-H）。表2提供了从这些重建粒子中提取的IMARIS图像分析软件生成的体积估计值以及用于木炭的大“篝火”粒子的粗略手动估计。可以看出，颗粒体积的手动估计显着大于使用IMARIS估计的那些。这是因为手动估计仅基于从捕获图像测量的粒子的长度和宽度（xy）以及通过每个粒子的焦平面的深度。因此，人工估算没有考虑表面形貌或颗粒轮廓的变化，可以清楚地看到图2中的变化。。这种比较强调了在没有计算机图像分析软件的情况下测量微量或中化石炭颗粒体积的难度，因此，这种组合的显微镜和图像分析技术确实提供了我们测量这些量的能力的真实改进。

图3显示了来自现代Miombo林地野火的微观和中观“化石”部分的示例性三维重建，图4和视频动画视频S1显示了使用古代白垩纪中化石颗粒的重建。使用这些重建，IMARIS能够估计在我们的每个样本类型中测量的100个粒子的三维体积和二维表面积。这使我们能够看到样品中包含的全部粒子体积和表面积。图5显示所有三个样品的测量粒子体积和表面积以增加的尺寸排序的全部范围，图表上的红线显示测量的中值。平均粒子体积为样品是125579微米3，6313344微米3和1227426微米3为现代的“微体”，现代“mesofossil”和分别白垩纪mesofossil样品。平均表面积是35225微米2，478260微米2，132949微米2，在上述所列的顺序相同（见表3有关粒子的完整尺寸信息）。如所预期的，“微化石”样品含有比“中化合物”部分中的任何一种都小得多的颗粒。然而，测量结果表明，现代“中化石”部分由比白垩纪中化石部分大得多的颗粒组成。现代“中化石”部分含有的颗粒平均（中位数）体积比白垩纪中化石部分大5倍，两个样品中颗粒的大小可以显示出相互之间的显着差异（Kruskall） Wallis p  = 1.86×10 -22）。现代样品中颗粒的表面积平均是白垩纪样品的2倍（Kruskall Wallis p = 1.45×10 -21）。我们注意到，在制备过程中或在样品的共聚焦激光扫描期间，这种变化对我们自己的眼睛来说并不明显。这突出了该方法用于确定样品之间木炭尺寸（体积和表面积）的明显细微变化的实用性。

 

在另一个窗口打开

图3

图像显示木炭的重建。

（A-D）Miombo林地木炭颗粒（A）的现代“mesofossil”部分的实例反射光图像（B-D）图像处理的三维重建，显示颗粒的所有侧面。（E-H）Miombo林地木炭的现代“微化石”部分。（E）反射光图像（F-H）图像处理的三维重建，显示颗粒的所有侧面。

 

图5

样品中表示的颗粒体积和表面积的范围。

红线是所有粒子的中位数。

图6显示了所有样品的测量颗粒表面积与测量体积之间的关系。在所有情况下，都存在正线性相关性（R 2 > 0.90，见图6）表面积和颗粒体积之间。我们使用IMARIS进一步测量了载玻片中颗粒的“形状”，IMARIS能够根据颗粒与球体或椭圆体的关系对颗粒进行评级。所有三个样品中的大多数颗粒在性质上具有特征性扁平（即表示扁平球体或椭圆体）。这解释了表面积与颗粒体积之间的良好相关性，因为它们的轴向深度（Z）与其XY面积相比相对较小。由于它们的浅深度，xy（面积）测量将相对代表颗粒的总尺寸，因为厚度是总颗粒的一小部分。我们可以预期线性面积 - 体积关系会在较大的木炭颗粒中分解，其可以是更立方的性质（例如，与化学成分相对的大化石），并且太厚（高轴向深度）以合理地安装在盖玻片下。或者，如果烧焦的植物材料的性质明显不同，那么这种关系可能不成立; 例如，薄烧焦的草角质层可能与烧焦木材的较大碎片具有不同的线性面积 - 体积关系。

在另一个窗口打开

图6

所有样品和大小分数的木炭颗粒表面积与体积关系。

黑线=最佳拟合回归线（显示R 2）。红线对应于根据y = 13×的预测。

讨论